في العالم الصغير من علوم الحياة ، قياس نشاط انزيم يشبه " نبض " مراقبة التفاعلات الكيميائية . طريقة الكشف عن β - جالاكتوسيداسي السائل المرحلة المتقدمة من قبل biochromatography أصبحت أداة هامة للباحثين لتحليل وظيفة الأنزيمية بسبب مبدأ فريدة من نوعها ومستقرة الأداء . كيف يمكن قياس نشاط β - جالاكتوسيداسي بدقة على أساس تكنولوجيا الكشف عن الركيزة محددة التحلل ؟ ما هي مجالات البحث لا يمكن الاستغناء عنه ؟

جوهر السائل المرحلة الكشف عن β - جالاكتوسيداسي هو رائع " الجزيئية تلطيخ فعل " . عندما β - جالاكتوسيداسي اجتمع في العينةo-nitrophenol-beta-d-galactoside ( ONPG )عندما الركيزة ، انزيم جزيء يشبه مقص الجزيئية الدقيقة التي تقطع غليكوزيد السندات في جزيء ONPG ، والإفراج عنo-nitrophenolالمنتجات .

هذه المادة الصفراءالطول الموجيامتصاص الأشعة فوق البنفسجية يمكن أن تنتج بعض الامتصاصية ، و قيمة الامتصاصية هو علاقة طردية خطية مع تركيز المنتج . لأن تركيز المنتج مباشرة يعكس كفاءة الحفاز الانزيم ، نشاط β - جالاكتوسيداسي في عينة يمكن حسابها بشكل غير مباشر من خلال قراءة قيمة الامتصاصية الإجار . هذا المبدأ يجعل من حسن استخدام خصوصية الانزيم و الخصائص البصرية من المنتجات ، وتحقيق التحول من التفاعلات الكيميائية إلى إشارات البيانات .

العملية : توحيد مسار البيانات من عينة

عملية الكشف عن الكائنات الحية الملونة مصممة وفقا لمبدأ " عملية بسيطة ، نتائج مستقرة " .

عينة مختلطة مع الركيزةالعينات التي سيتم الكشف عنها ( على سبيل المثال ، lysates الخلية ، وتنقية انزيم الحل ) مختلطة مع ONPG الركيزة في نسبة لضمان الاتصال الكامل بين جزيئات انزيم الركيزة . تركيز الركيزة1-5 مول / لترمن أجل ضمان رد فعل في حالة تشبع انزيم .

درجة حرارة ثابتة الحضانة: سائل مختلطاحتضان لمدة 15-60 دقيقة في 37 ℃ حمام مائي( وقت محدد اعتمادا على نشاط انزيمقبلتحديد التجربة هذه الخطوة تحتاج إلى رقابة صارمة على تقلبات درجة الحرارة لتجنب تأثير درجة الحرارة على نشاط انزيم الانحراف .

إنهاء الردانضممحلول هيدروكسيد الصوديوم 0.5 مول / لتركما وقف السائل ، انزيم جزيء هو لمسخ وتعطيل من خلال alkalization البيئة ، رد فعل الحفاز هو توقف بدقة . إضافة كمية من إنهاء الحل هو عادة 1 / 5 من مجموع حجم نظام رد الفعل .

تحديد الامتصاصيةعلى الفور نقل رد فعل السائل إلى الكوارتز طبق اللونية ، الامتصاصية يقاس الإجار في 420nm الطول الموجي . العملية المطلوبة فيفي غضون 5 دقائقرد فعل ثانوي من o-nitrophenol تحت ظروف قلوية يمكن منعه .

العملية برمتها من معالجة العينات إلى قراءة البيانات فقطحوعلاوة على ذلك ، يمكن الكشف عن تدفق عالية من خلال 96 فتحة لوحة ، وبالتالي حد كبير في تحسين الكفاءة التجريبية . . . . . . .

حساب النشاط الأنزيمي : الانتقال من الامتصاصية إلى وحدة دولية

حساب النشاط الأنزيمي هو خطوة رئيسية في تحويل قراءات الإجار في الأهمية البيولوجية . طريقة الحساب على أساس التوصية البيولوجية الملونةطريقة منحنى القياسية، خطوات محددة على النحو التالي :

رسم المنحنى القياسيسلسلة من o-nitrophenol الحلول القياسية ( عادة 0-200 μ mol / لتر ) مع تركيز معروف تم إعدادها لتحديد 420nm الامتصاصية في كل تركيز .y = kx + b( ك ) المنحدر ، و ( ب ) اعتراض .

حساب تركيز المنتجتركيز o-nitrophenol ( μ mol / لتر ) في رد فعل السائل تم استخلاصه .

تحويل وحدة نشاط انزيموفقا لتعريف اللجنة الدولية لعلم الإنزيمات ، وحدة نشاط انزيم ( ش ) يشير إلىكمية الانزيم المحفز 1 μ mol الركيزة عملة في الدقيقةمنتدى

بيتا جالاكتوسيداسي ، كنموذج انزيم ، وقد تم تطبيقها على نطاق واسع في مجال علوم الحياة . وقد تم التحقق من طرق الكشف عن الكائنات الحية المزهرة وتطبيقها على السيناريوهات التالية :

تنظيم التعبير الجينيفيلاك مشغل فرعيفي هذه الدراسة ، β - جالاكتوسيداسي غالبا ما تستخدم مراسل الجينات ، والتي يمكن أن تعكس كثافة المروج أو تنظيم تأثير عوامل النسخ . باستخدام هذا الأسلوب ، ثلاثة عوامل النسخ الجديدة التي تنظم اللاكتوز الأيض في القولونية تم فرزهم بنجاح من قبل مختبر الجامعة ( بيانات نشرت في مجلة علم الجراثيم ، 2024 ، 206 ( 3 ) : e00682-23 ) .

تقييم هندسة الإنزيمنشاط الحفاز من المسخ يجب أن يكون منخول في تدفق عالية في اتجاه تطور التجربة . 96 - ثقب لوحة الكشف عن مخطط يمكن أن تتحقق .تحديد نشاط 2000 المسوخ في يوم واحدمقارنة مع الطريقة التقليدية ، وتحسين كفاءة الفحص 300 ٪ ، وتسريع عملية البحث والتطوير من انزيم الهندسة .

نموذج تشخيص المرضgalactosidase نشاط غير طبيعي والليزوزومية التخزين( على سبيل المثال ، GM1 الغانغليوزيدات التخزين ) . باستخدام هذا الأسلوب ، وجد الفريق أن نشاط انزيم في المرضى الذين يعانون من fibroblasts12-15%[ الهدف ] إلى توفير أساس مختبر التشخيص المبكر للمرض .

رصد الملوثات البيئيةبعض ايونات المعادن الثقيلة ، مثل الزئبق والرصاص ، يمكن أن تمنع β - جالاكتوسيداسي النشاط ، حتى يجمد انزيم يمكن استخدامها بوصفها جهاز الاستشعار البيولوجي لتقييم تلوث المياه عن طريق الكشف عن التغيرات في نشاط انزيم . في الممارسة العملية ، تثبيط نشاط انزيم نسبة تركيز الزئبق0.1-10 ميكرومول / لترمجموعة جيدة العلاقة الخطية .

مزايا و نقاط الاهتمام في طريقة

مقارنة مع التقليدية أو العلامات النظائر مضان ، السائل المرحلة طريقة الكشف عن الكائنات الملونة لديها ثلاث مزايا :منخفضة التكلفةلا تكلفة ركائز الفلورسنتعملية آمنة( تجنب استخدام المواد المشعة )التوافق قوية( مناسبة لأنّ كلّ أنواع العينة ) . ومع ذلك ، ينبغي إيلاء الاهتمام إلى النقاط التالية أثناء التجربة :

إذا كانت العينة تحتوي علىالحد من وكيل( على سبيل المثال ، DTT ) يمكن أن تتداخل مع لون o-nitrophenol ، تحتاج إلى إزالة غسيل الكلى في وقت مبكر .

تركيز عالالبروتين أو الحمض النوويامتصاص الخلفية قد تحدث ، فمن المستحسن أن الطرد المركزي ( 12000 × ز ، 10 دقيقة ) لإزالة الرواسب قبل الكشف .

إذا كان نشاط انزيم عالية جدا ، عينة يجب أن تكون مخففة بشكل صحيح لضمان الامتصاصية ضمن مجموعة خطية من منحنى القياسية ( عادة ما بين 0.1 و 1 ) .

مع تطور علوم الحياة ، β - جالاكتوسيداسي سوف تستخدم على نطاق واسع باعتبارها الإنزيمات الأيضية الأساسية مراسل الجينات . مع الدقة والراحة ، السائل المرحلة طريقة الكشف عن الكائنات الحية مزدهرة اللون أصبح مساعد قوي للباحثين ، والتي يمكن أن توفر الدعم التقني الموثوق بها لدراسة وظيفة انزيم ، واستكشاف آلية المرض والرصد البيئي .