في المختبر اختبار تعزيز توليف الكولاجين مستحضرات التجميل

في المختبر اختبار تعزيز توليف الكولاجين مستحضرات التجميل

مبدأ الكشف عن مسار التقنية

الكولاجين هو العنصر الأساسي في الحفاظ على مرونة الجلد ، والتي تؤثر بشكل مباشر على القدرة على تخليق الجلد التجاعيد وإصلاح وظيفة . الهدف : إنشاء نموذج مثقف الخلايا الليفية لمحاكاة البيئة الفسيولوجية من الأدمة ، وتقييم تأثير تحفيز الكولاجين الحيوي في مستحضرات التجميل في المختبر . الهدف من هذه الدراسة هو دراسة التغيرات في القدرة على تخليق الكولاجين في الجلد البشري الليفية ( HDF ) أو خلد خط الخلايا الليفية ( على سبيل المثال ، nhdf ) تحت ظروف ثقافة موحدة ( 37 ℃ ، 5 ٪ CÒ ، الرطوبة 95 ٪ ) ، بعد تدخل من اختبار المواد .

تم تصميم التجربة باستخدام أسلوب التدرج في التركيز ( عادة 0.01 في المائة ، 0.1 في المائة ، 1 ٪ من ثلاث مجموعات الجرعات ) في وقت واحد مع مجموعة مراقبة فارغة ( المصل خالية من المتوسط ) و ( مراقبة إيجابية weishengsu ج 100 μ mol / لتر ) ، لضمان نتائج المقارنة والموثوقية . التكنولوجيا الرئيسية على أساس مبدأ أن الخلايا الليفية يمكن أن تحفز إفراز الكولاجين من النوع الأول من خلال تفعيل تحويل عامل النمو اختبار السمية ( MTT ) يجب أن تتم في وقت واحد ، و معدل البقاء على قيد الحياة هو أكثر من 80 ٪ في تركيز فعال ، وبالتالي القضاء على التدخل من انتشار الخلايا أو سمية .

طريقة الاختبار الأساسية وتوحيد تدفق

تحديد النوع الأول من الكولاجين بواسطة انزيم مرتبط المناعي فحص ( ELISA )

الكولاجين من النوع الأول ( col1 ) تم الكشف عنها بواسطة انزيم مرتبط المناعي ( ELISA ) في خلية ثقافة supernatants . تدفق العملية بدقة وفقا غيغابايت / تي 35828-2018 " المبادئ التوجيهية لاختبار فعالية 3D نماذج الجلد مستحضرات التجميل في المختبر " . وتشمل الخطوات المحددة ما يلي :

عينة المعالجة : طاف من الخلايا التي تم جمعها بعد 72 ساعة من التدخل ، ثم طرد في 4 ℃ 12000 دورة في الدقيقة لمدة 10 دقائق لإزالة الشوائب .

الأجسام المضادة وحيدة النسيلة المضادة لحقوق col1 ( 1 : 1000 ) المغلفة مع 96 لوحة المسام ، احتضنت في 4 ℃ بين عشية وضحاها .

مستضد ملزمة : أضيفت عينات ومعيار التدرج تمييع ( 0-200 نانوغرام / مل ) و حضنت في 37 ℃ لمدة 2 ساعة .

رد فعل اللون : إضافة HRP المسمى الأجسام المضادة ( 1 : 2000 تمييع ) و TMB الركيزة ، ثم تحديد الامتصاصية في 450nm الطول الموجي .

حساب البيانات : تركيز col1 تم تحويلها من خلال منحنى القياسية ، مقارنة مع المجموعة الضابطة ، فإن نسبة المزج بين المجموعة التجريبية والمجموعة الضابطة .

التحقق من مستوى الجينات : الكشف عن col1a1 التعبير في الوقت الحقيقي الاسترداد

من أجل الكشف عن الآلية الجزيئية الكولاجين التوليف ، في الوقت الحقيقي الاسترداد الكمية الفلورسنت ( qpcr ) كان يستخدم للكشف عن مستوى col1a1 النسخ الجيني .

مجموع استخراج الحمض النووي الريبي : تريزول طريقة تقسيم الخلايا ، تركيز الحمض النووي الريبي يقاس nanodrop ( نسبة a260 / a280 1.8-2.0 ) ؛

النسخ العكسي : كدنا تم توليفها من قبل primescript RT كيت في 37 ℃ لمدة 15 دقيقة و 85 ℃ لمدة 5 ثوان .

qpcr التضخيم : مع gapdh مثل الجينات المرجعية الداخلية ، col1a1 التمهيدي و : 5 ' - gagggccaagacgaacatc-3 ' , R : 5 ' - cagatcacgtcgccaac-3 ' , تم تضخيمه في lightcycler 480 ( 10 دقائق في 95 ℃ ، 40 دورات في 95 ℃ 15 ثانية في 60 ℃ 30 ثانية ) .

النتائج : التعبير النسبي col1a1 تم حسابها باستخدام 2 ^ ( - delta-ct ) طريقة التعبير الجيني يجب أن يصل التنظيم أكثر من 1.5 مرة في المواضيع الإيجابية ، وهو ما يتسق مع مستوى البروتين .

معايير مراقبة الجودة والنتائج

تجربة نظام مراقبة الجودة

ضمان جودة الخلية : استخدام الجيل 3-10 لوغاريتمي مرحلة نمو الخلايا ، تلقيح الكثافة في 5 × 10 خلايا / سم ⁴ لضمان خلية التصاق معدل > 90 ٪ ؛

كاشف التوحيد : مصل بقري جنيني ( FBS ) يحتاج إلى الكشف عن الميكوبلازما ، وتركيز انزيم البنكرياس دان كان 0.25 ٪ و 0.02 ٪ EDTA .

متطلبات الدقة : درجة الحرارة تقلب المشارك ₂ حاضنة ≤ ± 0.1 ℃ ، قيمة الرقم الهيدروجيني هو الحفاظ على 7.2-7.4 . سوبر نظيفة المنضدة يجب أن تصل إلى مستوى ايزو 5 ( الجسيمات العالقة ≤ 3520 / م 3 ) ؛

طريقة التحقق من صحة : دقة تحديد وضع اللاجئ في إليسا أقل من 8 ٪ ، دقة تحديد المواقع بين دفعات أقل من 12 ٪ ، معدل استرداد 90 ٪ - 110 ٪ ؛ qpcr التضخيم كفاءة 90 ٪ - 110 ٪ ، معامل الارتباط ص > 0.99 .

نتيجة تحديد عتبة

المعيار الأساسي : في غير تركيز السامة للخلايا ( معدل البقاء على قيد الحياة أكثر من 80 ٪ ) ، أي من الشروط التالية يمكن أن تعتبر إيجابية :

محتوى الكولاجين من النوع الأول كان أكثر من 20 ٪ أعلى من السيطرة على المجموعة . p<0.05);

التعبير عن col1a1 يصل التنظيم ≥ 1.5 مرة ( qpcr ، p<0.05)。

تعزيز متطلبات التحقق : المنتجات التي تدعي أن " تعزيز تخليق الكولاجين بشكل كبير " يجب أن تلبي متطلبات زيادة مستويات البروتين أكثر من 30 ٪ و زيادة مستويات الجينات أكثر من 2 مرات ، وتوفير ما لا يقل عن ثلاث تجارب مستقلة تكرار البيانات .

المزايا التقنية والامتثال ضمان اختبار المؤسسة

مرافق الأجهزة والقدرات التقنية

وقد تم تجهيز مركز اختبار CKE مع مختبر السلامة البيولوجية من الدرجة الثالثة ، وتشمل المعدات الأساسية :

كامل تلقائي نظام خلية ثقافة ( الحرارية عرض ) : تحقيق في الوقت الحقيقي رصد درجة الحرارة وتركيز CO ₂ والتنبيه .

تدفق عالية اليسا محطة العمل ( biotek 800ts ) : دعم 96 عينة في وقت واحد الكشف عن الحد الأدنى من 0.1pg / ml ؛

مضان الكمية PCR ( روش lightcycler 96 ) : مجهزة بسرعة رفع درجة الحرارة وحدة ، تجربة واحدة يمكن أن تكتمل في غضون 2 ساعة .

خلية نظام التصوير ( أوليمبوس ix73 ) : التحليل الكمي الكولاجين المناعي كثافة مع imagej البرمجيات .

وي المؤهل و مصداقية البيانات

مختبر معتمد من قبل وكالة الفضاء الكندية ( شهادة رقم l22006 ) و هيئة سوق المال المؤهل .

المعايير الوطنية : جيجابايت / تي 35828-2018 " مستحضرات التجميل الجلد في المختبر نموذج اختبار المبادئ التوجيهية " ؛

المعايير الدولية : منظمة التعاون والتنمية في الميدان الاقتصادي تيراغرام 439 " في المختبر اختبار تهيج الجلد " ، ايزو 10993-5 " اختبار السمية .

دليل الصناعة : المبادئ التوجيهية لتقييم فعالية مستحضرات التجميل مستحضرات التجميل المطالبات ( 2021 ) .

خدمة اختبار مخصص

سلسلة كاملة من الدعم التقني لأنواع مختلفة من مستحضرات التجميل :

اختيار المواد الخام : المكونات النشطة مثل مستخلصات نباتية ، الببتيدات ، وما إلى ذلك في المختبر قبل النخل ، وتقصير فترة البحث والتطوير .

الصيغة الأمثل : تقييم تأثير المواد الحافظة و جوهر على توليف الكولاجين النشاط ، وتحسين نظام مركب .

التحقق من الاستقرار : تخزين لمدة 28 يوما في 4 ℃ 25 ℃ 40 ℃ لرصد تأثير تدهور المكونات النشطة على الكفاءة .

بيانات الخدمات ذات القيمة المضافة : توفير تحليل المسار الجيني col1a1 ، العنصر النشط ic50 / ec50 حساب عمق تفسير البيانات .

التطبيقات الصناعية و الحالات النموذجية

بعد 48 ساعة من العلاج ، إفراز الخلايا الليفية col1 بنسبة 42.3 في المائة ( ف < 0.01 ) ، والتعبير عن col1a1 مرنا بنسبة 2.1 مرة ، و بقاء الخلايا بنسبة 91.7 في المائة . البيانات التي تدعم نجاح " تعزيز تخليق الكولاجين " فعالية المطالبات ، تقارير الاختبار ذات الصلة كأساس للتسجيل من قبل الدولة المخدرات جيان المكتب . الممارسة تبين أن معيار اختبار تخليق الكولاجين في المختبر يمكن أن تحل على نحو فعال محل التقليدية في التجارب على الحيوانات ، وفي الوقت نفسه ضمان دقة الاختبار ، والحد بشكل كبير من تكاليف البحث والتطوير و الجدل الأخلاقي ، وتوفير الدعم العلمي والتقني لتقييم فعالية مستحضرات التجميل .