yac-1 خلية ثقافة خاصة متوسطة

نقاط التشغيل :

خطوات زراعة الخلايا

أولا - وسائل الإعلام وشروط الحفظ بالتبريد :

1 ) dmem-h متوسطة ( 1.5g / l NaHCO3 أضيفت ) ، 90 ٪ ؛ مصل بقري جنيني 10% . تعليق وسائل الإعلام يمكن أن تستخدم أيضا في تعليق 293t الخلايا .

2 ) الثقافة شرط : بخار المرحلة : الهواء ، 95 ٪ ؛ ثاني أكسيد الكربون درجة الحرارة : 37 درجة مئوية ، حاضنة الرطوبة 70 ٪ - 80 ٪ .

3 ) تجميد السائل : 90 ٪ متوسطة الثقافة ، 10 ٪ دمسو النيتروجين السائل التخزين .

ثانيا - معالجة الخلايا :

1 ) استعادة الخلايا : تجميد أنبوب يحتوي على 1 مل من تعليق الخلية بسرعة يهز و يذوب في حمام مائي في 37 درجة مئوية ، إضافة 4 مل متوسطة الثقافة إلى مزيج متجانس . بعد الطرد المركزي لمدة 4 دقائق في 1000 دورة في الدقيقة ، supernatants تم التخلص منها ، و 1-2ml متوسطة الثقافة أضيفت إلى الخليط ثم تهب بالتساوي . ثم كل تعليق خلية أضيفت إلى قارورة الثقافة بين عشية وضحاها ( أو تعليق خلية أضيفت إلى 10 سم طبق ، حوالي 8 مل متوسطة الثقافة أضيفت إلى الثقافة بين عشية وضحاها ) . تغيير السوائل في اليوم التالي و فحص كثافة الخلية .

2 ) مرور الخلية : إذا كانت كثافة الخلية تصل إلى 80 ٪ - 90 ٪ ، يمكن أن تحمل على مرور الثقافة .

على خلايا ملتصقة ، مرور يمكن الرجوع إلى الطرق التالية :

1 - إزالة طاف ، وغسل الخلايا مع برنامج تلفزيوني بدون أيونات الكالسيوم والمغنيسيوم 1-2 مرات .

2 - إضافة 2 مل من السائل الهضمي ( 0.25 في المائة trypsin-0.53mm EDTA ) في الثقافة قارورة ، ووضعها في حاضنة في 37 ℃ لمدة 1-2 دقيقة ، ثم لاحظ تحت المجهر الهضم ، إذا كان معظم الخلايا تصبح مستديرة و تسقط ، بسرعة العودة إلى طاولة العمليات ، اضغط على عدة زجاجات الثقافة ، إضافة كمية صغيرة من وسائل الإعلام لإنهاء عملية الهضم .

3 - الضغط على 6-8ml / زجاجة متوسطة ، برفق فاز وامتصاص ، الطرد المركزي في 1000 دورة في الدقيقة لمدة 4 دقائق ، تجاهل طاف ، إضافة 1-2ml متوسطة ، ثم تهب بالتساوي .

4 - تقسيم تعليق خلية جديدة في طبق أو زجاجة تحتوي على 8 مل متوسطة الثقافة في نسبة 1 : 2 إلى 1 : 5 .

3 ) الحفاظ على الخلايا : عندما تكون الخلايا في حالة جيدة من النمو ، يمكن الحفاظ على الخلايا بالتبريد . عندما الخلايا الملتصقة بالتبريد ، إضافة كمية صغيرة بعد التخلص من الثقافة المتوسطة ، بعد أن تصبح الجولة ، تقشر الخلايا ، إضافة حوالي 1 مل من الثقافة المتوسطة التي تحتوي على مصل الدم ، إضافة إلى تجميد أنبوب ، ثم إضافة 10 ٪ DMSO بعد التجميد .

طريقة تجميد الخلايا ؟

طريقة الحفظ بالتبريد : تجميد أنبوب يوضع في 4 ℃ 30 ~ 60 دقيقة ( - 20 ℃ 30 دقيقة * ) - 80 ℃ 16 ~ 18 ساعة ( أو بين عشية وضحاها ) → النيتروجين السائل خزان vaporphase التخزين على المدى الطويل .

طريقة الحفظ بالتبريد 2 : تجميد أنبوب يوضع في برمجة آلة التبريد مع مجموعة من الإجراءات التي يمكن أن تقلل من 1-3 درجة مئوية إلى أقل من 80 درجة مئوية في الدقيقة ، ثم يوضع في خزان النيتروجين السائل vapor المرحلة للتخزين على المدى الطويل . - 20 ℃ لا أكثر من 1 ساعة لمنع بلورات الجليد كبيرة جدا ، مما تسبب في موت الخلايا ، يمكنك تخطي هذه الخطوة مباشرة في الثلاجة - 80 ℃ ، ولكن معدل البقاء على قيد الحياة أقل قليلا .